? ? ?中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞，已成為治療用蛋白類生物制品生產(chǎn)的主要細(xì)胞類型。隨著瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)(transient transfection)的進(jìn)步，搭配CHO細(xì)胞進(jìn)行毫克至克級別蛋白的快速、高效生產(chǎn)，幫助推動藥物研發(fā)階段進(jìn)程，允許更早的評估候選藥物是否具備理想屬性，從而投入更多資源生成穩(wěn)定的克隆細(xì)胞系，用于后續(xù)藥物的臨床開發(fā)。
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? ? ? ?憑借20年在核酸遞轉(zhuǎn)領(lǐng)域的深耕細(xì)作，Mirus推出了用于CHO細(xì)胞蛋白/抗體生產(chǎn)的完整瞬轉(zhuǎn)系統(tǒng)——CHOgro? High Yield Expression System。通過整合Mirus獨有的專利轉(zhuǎn)染技術(shù)及優(yōu)化的CHO培養(yǎng)基，相比于現(xiàn)有技術(shù)方案，可將蛋白表達(dá)量提升2-10倍。除此之外，該系統(tǒng)不含動物源性成分，致力于穩(wěn)定的提高懸浮CHO細(xì)胞的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。本文首先就影響CHO細(xì)胞在蛋白表達(dá)實驗中的關(guān)鍵影響因素進(jìn)行討論，包括轉(zhuǎn)染試劑、培養(yǎng)基選擇、增強子使用及培養(yǎng)溫度優(yōu)化；Mirus CHOgro? High Yield Expression System體系，綜合考慮上述影響CHO蛋白表達(dá)的關(guān)鍵因素，并且將轉(zhuǎn)染試劑、培養(yǎng)基及增強子進(jìn)行優(yōu)化、整合；最后，結(jié)合Mirus CHOgro? High Yield Expression System針對不同蛋白/抗體類型的表達(dá)產(chǎn)量、體系放大以及細(xì)胞類型適配性數(shù)據(jù)，充分證明了Mirus CHOgro? High Yield Expression System具備高產(chǎn)量、高穩(wěn)定性、廣泛的適配性以及操作靈活性等優(yōu)勢。

Mirus CHOgro? High Yield Expression System（產(chǎn)品貨號：MIR 6270）中包括了以下組分：

CHO細(xì)胞蛋白表達(dá)關(guān)鍵影響因素之轉(zhuǎn)染試劑

CHOgro? High Yield Expression System系統(tǒng)中關(guān)鍵組分TransIT-PRO?轉(zhuǎn)染試劑，通過優(yōu)化瞬時轉(zhuǎn)染效率，可進(jìn)一步提高目標(biāo)蛋白/抗體產(chǎn)量。同樣的，該轉(zhuǎn)染試劑不含動物源成分，可以與懸浮CHO或者293細(xì)胞搭配使用，并且可以兼容不同種類的培養(yǎng)基，旨在提高生產(chǎn)蛋白/抗體產(chǎn)量及穩(wěn)定性。

測試使用CHOgro? High Yield Expression System系統(tǒng)中TransIT-PRO?轉(zhuǎn)染試劑（試劑:DNA比例為1:1），在CHO-S細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)表達(dá)GFP熒光蛋白。轉(zhuǎn)染后48小時，分別使用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測試劑轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活力。結(jié)果表明，單獨使用TransIT-PRO?轉(zhuǎn)染試劑，可達(dá)到高水平的轉(zhuǎn)染效率（圖1）。

圖1. 單獨使用Mirus CHOgro? High Yield Expression系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)染試劑（TransIT-PRO? 轉(zhuǎn)染試劑），也有著高水平的轉(zhuǎn)染效率。

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CHO細(xì)胞蛋白表達(dá)實驗關(guān)鍵影響因素之培養(yǎng)基

CHOgro? High Yield Expression System中的另一關(guān)鍵組分CHOgro? Expression Medium，也是提升CHO細(xì)胞蛋白/抗體表達(dá)量的重要因素。細(xì)胞的生長狀態(tài)、是否結(jié)團(tuán)、細(xì)胞密度等都是評估CHO細(xì)胞培養(yǎng)基的關(guān)鍵參數(shù)。

在細(xì)胞生長狀態(tài)方面，轉(zhuǎn)染FreeStyle? CHO-S細(xì)胞后，分別在CHOgro? Expression Medium和其他品牌培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后六天，用CHOgro? High Yield Expression System中的CHOgro? Expression Medium培養(yǎng)的細(xì)胞結(jié)團(tuán)數(shù)量明顯少于其他品牌培養(yǎng)基（圖2）。

圖2. 使用Mirus CHOgro? High Yield Expression System中的CHOgro? Expression Medium進(jìn)行培養(yǎng)（左），細(xì)胞結(jié)塊數(shù)量顯著少于其他培養(yǎng)基培養(yǎng)的CHO-S細(xì)胞（右）。

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同樣的，使用相同細(xì)胞系（FreeStyle? CHO-S）及細(xì)胞密度（0.5×106 cells/ml），平行比較Mirus CHOgro? Expression培養(yǎng)基及其他品牌培養(yǎng)基。實驗結(jié)果顯示，在Mirus CHOgro? Expression培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞，有著更高的細(xì)胞密度，這也是提高CHO細(xì)胞蛋白/抗體產(chǎn)量的重要前提。并且，在更高的細(xì)胞密度條件下，仍保持較高的細(xì)胞活性（圖3）。

圖3. 使用CHOgro? Expression Medium培養(yǎng)，CHO細(xì)胞密度更高，并且保持著較高細(xì)胞活性。

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CHO細(xì)胞蛋白表達(dá)實驗關(guān)鍵影響因素之增強子

使Mirus研發(fā)團(tuán)隊針對不同應(yīng)用或者細(xì)胞類型，開發(fā)出多種相適配增強子，例如針對CHO細(xì)胞蛋白/抗體生產(chǎn)的增強子CHOgro? Titer Enhancer，也是包含在CHOgro? High Yield Expression System中的一個關(guān)鍵組分。其作用機(jī)制并非直接增加細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，而是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)特定的信號通路來增加CHO細(xì)胞的蛋白表達(dá)滴度。平行實驗分別對比了CHO細(xì)胞對Fc融合蛋白與IgG的表達(dá)量，結(jié)果表明，與單獨使用TransIT-PRO? 轉(zhuǎn)染試劑相比，加入CHOgro? Titer Enhancer后，CHO細(xì)胞Fc融合蛋白的產(chǎn)量有顯著提升（圖4）。此外，與PEI轉(zhuǎn)染體系相比，使用CHOgro系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染試劑和增強子，CHO細(xì)胞IgG的表達(dá)量可提高約3倍（圖5）。

圖4. 加入CHOgro? Titer Enhancer后，CHO細(xì)胞Fc融合蛋白的產(chǎn)量有顯著提升

圖5. TransIT -PRO?轉(zhuǎn)染試劑搭配CHOgro? Titer Enhancer，相較于PEI轉(zhuǎn)染體系，CHO細(xì)胞IgG的表達(dá)量可提高約3倍

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CHO細(xì)胞蛋白表達(dá)實驗關(guān)鍵影響因素之培養(yǎng)溫度

Mirus CHOgro? High Yield Expression System除了通過培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)染試劑以及增強子三者的優(yōu)化結(jié)合，在實驗流程上也可以進(jìn)行優(yōu)化，從而進(jìn)一步提高蛋白產(chǎn)量。根據(jù)科研或者不同應(yīng)用需求，Mirus CHOgro? High Yield Expression System有著多種靈活實驗方案供選擇：

方案一：Mirus CHOgro? High Yield Expression System實驗方案中所推薦的標(biāo)準(zhǔn)流程，即在轉(zhuǎn)染當(dāng)天加入CHOgro? Titer Enhancer，并立刻將細(xì)胞培養(yǎng)溫度從37℃轉(zhuǎn)移至32℃，轉(zhuǎn)染后7-8天內(nèi)收獲蛋白，細(xì)胞活性仍可保持70%以上；

方案二：在方案一的基礎(chǔ)上通過添加補料來延長細(xì)胞培養(yǎng)時間，保證細(xì)胞更長時間維持較高的密度和活率，將蛋白收獲時間延長至7-11天；

方案三：轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞仍維持在37℃條件下培養(yǎng)，不加入補料，并在最短時間（4-5天）收獲蛋白；

方案四：轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞仍維持在37℃條件下培養(yǎng)，通過在轉(zhuǎn)染后18-24小時添加補料維持細(xì)胞密度和活率，將蛋白收獲時間延長至4-7天。（有關(guān)添加細(xì)胞培養(yǎng)補料以維持細(xì)胞活率的建議，請參閱完整版實驗方案）（圖6）。

圖6. CHOgro? High Yield Expression System的多種細(xì)胞培養(yǎng)方案

基于以上四種實驗方案，分別測試了在轉(zhuǎn)染后32℃和37℃培養(yǎng)條件下，以及是否添加補料對CHO細(xì)胞IgG產(chǎn)量的影響。實驗使用CHOgro? High Yield Expression System，加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物及CHOgro? Titer Enhancer后，立即將CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)移至32℃（左）或保持在37℃（右）。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到32℃條件下培養(yǎng)，IgG產(chǎn)量更高且細(xì)胞存活時間更長（圖7）。

圖7. 轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到32℃條件下培養(yǎng)，IgG產(chǎn)量更高且細(xì)胞存活時間更長

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盡管Mirus CHOgro? High Yield Expression System從CHO細(xì)胞蛋白表達(dá)實驗關(guān)鍵組分即轉(zhuǎn)染試劑、培養(yǎng)基和增強子進(jìn)行了優(yōu)化整合，并提供了靈活的實驗應(yīng)用方案來提升CHO細(xì)胞的蛋白產(chǎn)量，那么在實際生產(chǎn)過程中，該系統(tǒng)針對不同類型蛋白/抗體的產(chǎn)量、體系放大以及細(xì)胞類型適配性如何呢？

Mirus CHOgro? High Yield Expression System針對不同類型蛋白/抗體的表達(dá)，有著更高產(chǎn)量

使用相同的細(xì)胞類型（FreeStyle? CHO-S cells）和質(zhì)粒骨架，分別表達(dá)六種不同的治療性抗體，比較測試了Mirus CHOgro? High Yield Expression System和其他品牌表達(dá)系統(tǒng)。實驗結(jié)果表明，在所有測試的六種抗體類型中，使用Mirus CHOgro? High Yield Expression System的CHO細(xì)胞表達(dá)的蛋白滴度更高，并且轉(zhuǎn)染試劑用量更少，蛋白生產(chǎn)成本更低（圖8）。

圖8. 相比其他品牌CHO轉(zhuǎn)染表達(dá)系統(tǒng)，Mirus CHOgro? High Yield Expression System有著更高的蛋白產(chǎn)量

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CHOgro? High Yield Expression System生產(chǎn)規(guī)模的可擴(kuò)展性

通過對6孔板（細(xì)胞培養(yǎng)體積2mL）至5L搖瓶（細(xì)胞培養(yǎng)體積2L）等不同培養(yǎng)體積進(jìn)行轉(zhuǎn)染，對CHOgro? High Yield Expression System生產(chǎn)規(guī)模的可擴(kuò)展性進(jìn)行評估，實驗結(jié)果表明，從最小反應(yīng)體系（6孔板）至最大反應(yīng)體系（5L搖瓶），生產(chǎn)體系放大了1000倍，都有著近似的蛋白滴度，意味著CHOgro? High Yield Expression System可以整合到不同CHO細(xì)胞蛋白/抗體研究和生產(chǎn)工作流中（圖9）。

圖9. Mirus CHOgro? High Yield Expression System的生產(chǎn)體系擴(kuò)大1000倍，依然保持著近似的蛋白產(chǎn)量。

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CHOgro? High Yield Expression System不同CHO細(xì)胞適配性

選擇兩種常用于蛋白/抗體生產(chǎn)的CHO懸浮細(xì)胞CHO-S和ExpiCHOTM，評估CHOgro? High Yield Expression System對不同CHO細(xì)胞類型的適配性。實驗結(jié)果表明，CHOgro? High Yield Expression System可適配多種CHO細(xì)胞類型，在不同CHO細(xì)胞中的蛋白表達(dá)也有著近似的產(chǎn)量（圖10）。

圖10. Mirus CHOgro? High Yield Expression System可適配不同CHO細(xì)胞類型

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綜合上述，通過上述Mirus CHOgro? High Yield Expression System的測評數(shù)據(jù)，表明了該系統(tǒng)具有以下特點及優(yōu)勢：

• 更高的蛋白產(chǎn)量：可將CHO細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)的蛋白表達(dá)量提升2-10倍
• 可穩(wěn)定放大生產(chǎn)體系：將轉(zhuǎn)染體系放大1000倍，其蛋白表達(dá)量依然保持穩(wěn)定
• 適配不同類型CHO細(xì)胞：搭配不同類型CHO細(xì)胞也可得到近似蛋白產(chǎn)量

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如何查找或選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑？

? ? 請登錄Mirus官網(wǎng)線上工具Reagent Agent?，支持超過1000種細(xì)胞類型、多種核酸類型轉(zhuǎn)染試劑查詢。

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Mirus產(chǎn)品年鑒

? ? ? ?美國Mirus公司成立于1995年，是世界上很早開發(fā)高效、低毒轉(zhuǎn)染試劑的公司，同時也是該類試劑的主要供應(yīng)商之一。其產(chǎn)品線涵蓋化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑、電轉(zhuǎn)染產(chǎn)品、病毒生產(chǎn)和轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)品，適用于基因功能研究、蛋白生產(chǎn)、病毒載體生產(chǎn)和動物模型構(gòu)建等領(lǐng)域。Mirus被公認(rèn)為轉(zhuǎn)染試劑開發(fā)的領(lǐng)跑者，其許多杰出成果獲得世界公認(rèn)與廣大用戶的好評。

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? ? 北京西美杰科技有限公司是Mirus中國區(qū)代理，始終秉承著專業(yè)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度為客戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)，Mirus熱銷轉(zhuǎn)染產(chǎn)品常備現(xiàn)貨。如果您對上述產(chǎn)品感興趣，歡迎致電北京西美杰客服熱線400-050-4006或登錄網(wǎng)站www.ejrobot.cn了解更多產(chǎn)品信息。

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